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豬鏈球菌的實驗室分離與鑒定

84農(nóng)業(yè)網(wǎng)　　時間：2018-03-14 　　作者：佚名　　來源：網(wǎng)絡(luò)整理

豬鏈球菌病（SwineStreptococcosis）是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種常見傳染病。在我國，對豬危害最嚴重的以C群獸疫鏈球菌為主，其次是D群，L群、S群和R群也可引起，E群主要引起關(guān)節(jié)炎和淋巴結(jié)膿腫。豬鏈球菌病在臨床上可分為敗血癥型、腦膜炎型、關(guān)節(jié)炎型、淋巴結(jié)膿腫型等。哺乳仔豬和剛斷乳仔豬發(fā)病主要以敗血癥型、腦膜炎型為主，發(fā)病率和死亡率均較高。肥育豬發(fā)病多以關(guān)節(jié)炎或淋巴結(jié)膿腫為特征，其死亡率較低，但影響生長發(fā)育。

2005年12月，鄭州南郊某豬場仔豬流行關(guān)節(jié)炎及敗血癥，多為2～6周齡仔豬;病豬精神不振，食欲減少或廢絕，體溫40.0℃～41.5℃，呈稽留熱，眼結(jié)膜潮紅，眼瞼稍水腫;多數(shù)病豬呼吸迫促;部分仔豬有關(guān)節(jié)炎癥狀，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、后肢不能站立;個別豬突然發(fā)病，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀;病死豬腹側(cè)皮膚及皮下瘀血，血液呈暗紅色，凝固不良，肺呈紅色，體積增大，切面有大量的紅色泡沫，脾、肝局部瘀血、腫脹，呈暗紅色，腸系膜淋巴結(jié)腫大，胃底部出血，四肢關(guān)節(jié)腔滑液多且渾濁。

根據(jù)臨床及剖檢，初步診斷為豬鏈球菌病，并無菌采取關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液及敗血癥病豬的肝、脾、肺及腸系膜淋巴結(jié)，經(jīng)實驗室分離鑒定，證實為豬鏈球菌�，F(xiàn)將分離鑒定結(jié)果報告如下。

1試驗材料

1.1病料無菌采患關(guān)節(jié)炎病豬的關(guān)節(jié)液，無菌采集急性死亡的病豬心血、肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)等病料。

1.2試劑染色液、常規(guī)試劑自行配制。

1.3培養(yǎng)基生化實驗用培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血清肉湯培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制，鮮血瓊脂平板由鄭州牧專實驗設(shè)備管理科提供。

1.4藥敏紙片由鄭州牧專實驗設(shè)備管理科提供。

1.5試驗動物健康小白鼠10只，由鄭州牧專動物醫(yī)藥系實驗動物中心提供，觀察一周，健康者做動物致病性實驗用。

2方法

2.1涂片鏡檢無菌采集急性死亡的病豬心血、肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)等病料，制作肝臟、脾臟的觸片，用關(guān)節(jié)液、心血涂片，干燥、火焰固定后進行革蘭氏染色鏡檢。

2.2細菌分離培養(yǎng)無菌采集的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等病料分別劃線接種鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～48小時后，觀察菌落特征，選取鮮血瓊脂平板上微小、圓形、邊緣整齊、略帶灰白色、露滴樣、有明顯的β型溶血環(huán)的單個菌落的小部分革蘭氏染色、顯微鏡檢查呈成對或短鏈狀革蘭氏陽性球菌后，菌落的其余部分再分別接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基、血清肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48小時，如此獲得分離菌的純培養(yǎng)物及在不同培養(yǎng)基上的生長情況。

2.3培養(yǎng)特性檢查觀察其在不同培養(yǎng)基上的生長情況，并涂片、染色、鏡檢。將純培養(yǎng)物接種于鮮血瓊脂斜面培養(yǎng)基，分別置于37℃、10℃和45℃條件下培養(yǎng)24～48小時，觀察其能否生長。

2.4生化試驗特性檢查分離菌血清肉湯培養(yǎng)物分別接種于各種生化培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48小時后，觀察其生化反應(yīng)特性。

2.5藥敏試驗采用紙片擴散法，根據(jù)藥敏試驗要求的距離，用無菌棉簽蘸取分離菌的肉湯培養(yǎng)物，涂布法接種于瓊脂平板;待稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)20～24小時，觀察結(jié)果，分別測定抑菌環(huán)的直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌環(huán)直徑在15mm以上為高度敏感，10～15mm為中度敏感，10mm以下為低度敏感，無抑菌環(huán)為不敏感。

2.6動物試驗健康小白鼠10只，隨機分為2組，每組5只，其中一組無菌吸取上述肉湯培養(yǎng)物0.5ml/只分別腹腔注射作為實驗組;另外一組5只小白鼠接種無菌生理鹽水做對照。每天觀察其死亡和發(fā)病情況。

3結(jié)果

3.1涂片鏡檢革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽性球菌，呈成對或短鏈狀排列。

3.2培養(yǎng)特性37℃培養(yǎng)24小時后，在鮮血瓊脂平板上形成半透明、表面光滑、微隆起的灰白色露珠狀的小菌落，外層有明顯的p溶血環(huán)，生長良好;在普通瓊脂平板上菌落貧瘠，比血瓊脂平板小;在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。染色鏡檢：革蘭氏陽性球菌，固體培養(yǎng)基中的呈3～5個連成鏈排列，液體培養(yǎng)基中的則呈4～8個連成鏈排列，或者更長。鮮血瓊脂斜面培養(yǎng)基10℃和45℃條件下培養(yǎng)24～48小時，均無生長，37℃生長良好。

3.3生化試驗結(jié)果見表1。表明生化反應(yīng)結(jié)果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。

表1分離菌生化試驗結(jié)果

葡萄糖＋甘露醇＋

山梨醇－楊苷＋

蔗糖＋麥牙糖＋

乳糖＋菊糖＋

棉實糖－葡萄糖＋

M-R試驗－三糖鐵＋

V-P試驗－靛基質(zhì)－

注："＋"表示大多數(shù)菌株為陽性;"－"表示大多數(shù)菌株為陰性。

3.4動物試驗結(jié)果5只兔子在接種后36～84小時呈現(xiàn)不同的癥狀變化，其中1只在接種后48小時左右衰竭死亡;1只在接種后72小時后衰竭死亡;另外3只表現(xiàn)為食欲減退、精神沉郁、頜下淋巴結(jié)腫脹。剖檢可見其肝、脾、腎腫大，膀胱高度充盈，胸腔積液，心冠脂肪出血，用死鼠的心血及胸腔積液涂片，革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有大量單個、成對或呈4～6個左右的短鏈革蘭氏陽性球菌。對照組5只小鼠一切正常。

3.5藥敏試驗結(jié)果見表2。敏感的藥物依次是頭孢菌素、青霉素、卡那霉素，而對環(huán)丙沙星、土霉素、鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、阿莫西林具有抗藥性。

表2藥敏試驗結(jié)果

藥物名稱頭孢菌素青霉素卡那霉素環(huán)丙沙星土霉素鏈霉素慶大霉素強力霉素阿莫西林

抑菌環(huán)直徑（mm）1817171087.5665

4分析與討論

根據(jù)該豬場分離菌株的形態(tài)染色特性、培養(yǎng)特性、生化特性及動物試驗，結(jié)合臨床診斷，確診為豬鏈球菌病。

該試驗分離到的菌株呈成對或短鏈排列，肉湯培養(yǎng)物多呈長鏈排列，革蘭氏陽性球菌，該分離菌株對營養(yǎng)要求較高，在鮮血瓊脂平板上生長良好，但在普通營養(yǎng)瓊脂平板上和麥康凱瓊脂平板上生長貧瘠或不生長。

藥敏試驗結(jié)果敏感的藥物依次是頭孢菌素、青霉素、卡那霉素，而對環(huán)丙沙星、土霉素、鏈霉素、慶大霉素、強力霉素、阿莫西林具有抗藥性。豬鏈球菌極易產(chǎn)生耐藥性，建議采用藥敏試驗篩選出的較敏感藥物對該豬場發(fā)病豬進行治療，可以起到較好的效果。

分群鑒定鏈球菌的方法主要是血清學(xué)試驗和生化試驗。其中，血清學(xué)試驗比較簡單可靠，但標(biāo)準(zhǔn)陽性血清不易獲得;生化試驗只能鑒定到群，無法進行定型鑒定。

利用本場分離菌株制備自家苗是預(yù)防豬鏈球菌的一種切實可行的辦法，保護率高，成本低。

病豬和帶菌豬是該病的重要傳染源。首先應(yīng)加強對健康豬的免疫，加強各個環(huán)節(jié)的管理，建立健全嚴格的防疫消毒制度。養(yǎng)豬場一旦發(fā)現(xiàn)病豬應(yīng)迅速隔離治療，對病死豬做無害化處理以防病原擴散，對被病豬污染的圈舍、場地、用具等進行嚴格消毒。

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