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針對(duì)豬圓環(huán)病毒的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

84農(nóng)業(yè)網(wǎng)　　時(shí)間：2018-03-14 　　作者：佚名　　來源：網(wǎng)絡(luò)整理

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒(PCV)感染引起的，以免疫抑制為特征的一類病毒性傳染病，臨床表現(xiàn)主要是由PCV-2引起的仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征。文章就近幾年國(guó)內(nèi)外對(duì)該病毒檢測(cè)技術(shù)，包括病毒分離、電鏡觀察、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、原位核酸雜交試驗(yàn)等的研究進(jìn)展做了闡述。

豬圓環(huán)病毒病是近年來倍受關(guān)注的一種在世界各地廣泛存在的慢性疾病，是一系列疾病的總稱。自1974年TischerI等[1]首次發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus，PCV)以來，隨著對(duì)PCV研究的深入，根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性及其基因組差異又可將其分為無致病性的豬圓環(huán)病毒1型(PCV-1)和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)。PCV-1對(duì)豬無致病性，但能產(chǎn)生血清抗體，在豬群中普遍存在，接種2日齡與9日齡的豬無臨床癥狀。PCV-2對(duì)豬有致病性，主要導(dǎo)致一種以斷奶仔豬呼吸急促或困難、腹瀉、貧血、明顯的淋巴組織病變和進(jìn)行性消瘦為特征的新的疾病，即斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。由于豬群中普遍存在著PCV抗體，單一的抗體陽(yáng)性不能確診為陽(yáng)性，確診必須依靠實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)出PCV-2抗原或核酸。由于病毒復(fù)制困難，所以檢測(cè)和防控研究非常困難。同時(shí)，該病易與一些病毒性和細(xì)菌性疾病混合或繼發(fā)感染，因此僅憑癥狀、病變及流行病學(xué)調(diào)查很難做出準(zhǔn)確判斷。為此，各國(guó)獸醫(yī)工作者進(jìn)行了大量的研究，建立了多種高度特異性的病毒學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法。文章就目前國(guó)內(nèi)外PCV的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　病毒分離

豬圓環(huán)病毒的分離培養(yǎng)多數(shù)是從病豬中采取肺、肝、脾、淋巴結(jié)和扁桃體等組織，制成組織勻漿，用氯仿處理除去有囊膜的病毒，接種PK-15細(xì)胞，利用氨基葡萄糖短時(shí)間處理感染細(xì)胞，以促進(jìn)病毒的增殖。呂艷麗等[2]從北京、河北分離了3株P(guān)CV-2，并對(duì)其中的2株進(jìn)行了測(cè)序，序列分析比較發(fā)現(xiàn)，它們與歐美分離毒株具有很高的同源性。郎洪武等[3]用Dulac豬腎傳代細(xì)胞分離到了2株圓環(huán)病毒。崔尚金等從我國(guó)的22個(gè)省市分離到了32株豬圓環(huán)病毒，并對(duì)其中6株進(jìn)行了測(cè)序，呈送到GenBank。另外，還有很多研究人員從各地分離到多株豬圓環(huán)病毒。

2　電鏡觀察

電鏡下可以觀察到一種較小病毒，是豬圓環(huán)病毒特有的直徑約為17nm的球型結(jié)構(gòu)，以及大量不同形態(tài)的胞漿內(nèi)包涵體。

3　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)做為一種快速、簡(jiǎn)便、特異的診斷方法，目前為病毒學(xué)診斷、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)最常用的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)為敏感、特異、快速、準(zhǔn)確。在PCV的檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛，且發(fā)展了很多改良的技術(shù)。

3.1　多重PCR檢測(cè)

HuangCI等[4]建立了一種簡(jiǎn)單的多重PCR法，可對(duì)PCV進(jìn)行檢測(cè)和定型。該方法設(shè)計(jì)了兩套引物，是根據(jù)PCV核酸鏈上的ORF1和ORF2設(shè)計(jì)的。CalsamigliaM等[5]建立了一種多重PCR法，可對(duì)PCV進(jìn)行檢測(cè)和定型。作者根據(jù)PCV-1和加拿大PMWS豬中分離的PCV-2的ORF1和ORF2序列設(shè)計(jì)兩套引物，這兩套引物都可以對(duì)PCV進(jìn)行檢測(cè)和定型。郎洪武等[3]根據(jù)PCV種的特異性和PCV-2型的特異性，設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)PCV。一對(duì)引物擴(kuò)增出的片段具有PCV種的特異性，擴(kuò)增區(qū)域是相對(duì)保守的ORF1部分核苷酸片段，大小約為900bp。另一對(duì)引物擴(kuò)增出的片段具有PCV-2型的特異性，擴(kuò)增區(qū)域呈可變性相對(duì)較大的ORF2部分的核苷酸片段，大小約為470bp。KimJ等[6]在2003年建立了石蠟包埋組織中同時(shí)檢測(cè)PCV-1、PCV-2和PPV多重套式PCR法，檢測(cè)了人工感染病例和自然感染病例，結(jié)果與原位雜交方法完全一致。

3.2　定量競(jìng)爭(zhēng)性PCR檢測(cè)

定量PCR是根據(jù)PCR的產(chǎn)物量來推斷其原始模板量。LiuQ等[7]建立了競(jìng)爭(zhēng)性PCR方法檢測(cè)血清中的PCV的DNA。選取PCV-1和PCV-2的ORF2中變異性高的區(qū)段設(shè)計(jì)兩對(duì)型特異性引物，并引入一個(gè)外源片段的重組質(zhì)粒，以此作為競(jìng)爭(zhēng)性模板，用上述兩對(duì)引物擴(kuò)增出的PCV-1或PCV-2片段能夠與野毒株的擴(kuò)增片段相區(qū)別。當(dāng)倍比稀釋的已知濃度的質(zhì)粒DNA和待測(cè)DNA共同的PCR產(chǎn)物的電泳條帶亮度相同時(shí)，便可以推算出待測(cè)DNA的濃度。崔尚金等[8]運(yùn)用此方法在試驗(yàn)過程中采用內(nèi)標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)模板，競(jìng)爭(zhēng)模板和目標(biāo)模板共用一個(gè)反應(yīng)體系，不僅降低了非內(nèi)標(biāo)性模板不同PCR反應(yīng)管間的差異，而且在對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)控監(jiān)測(cè)，排除了假陰性結(jié)果。

3.3　復(fù)合PCR檢測(cè)

復(fù)合PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，即在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，擴(kuò)增多個(gè)基因片段，此法方便快捷，已廣泛用于醫(yī)學(xué)臨床診斷。蘆銀華等[9]應(yīng)用復(fù)合PCR，在同體系中用3條引物擴(kuò)增PCV兩種血清型的DNA片段，從而達(dá)到PCR擴(kuò)增一次就可檢測(cè)鑒別PCV-1和PCV-2的目的。試驗(yàn)從PK-15細(xì)胞中擴(kuò)增出了PCV-1和PCV-2特異的基因片段，表明復(fù)合PCR方法的建立，為PCV的檢測(cè)、分型及臨床PMWS的診斷提供了有效的工具。朱軍莉等[10]采用復(fù)合PCR，對(duì)浙江、上海等地的豬場(chǎng)，具有明顯的“高熱綜合征”臨床表現(xiàn)豬的淋巴結(jié)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCV-2的陽(yáng)性率為39.40%，而PCV-1的陽(yáng)性率為33.33%。

3.4　PCR-RFLP檢測(cè)

PCR-RFLP是指在生物進(jìn)化過程中，DNA堿基序列發(fā)生插入、缺失或突變，從而改變了限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，是以PCR快速有效的擴(kuò)增微量的DNA，再利用限制酶進(jìn)行多態(tài)性分析的試驗(yàn)方法。FenauxM等[11]利用PCR-RFLP對(duì)PCV-1和PCV-2進(jìn)行檢測(cè)和定型。根據(jù)PCV-1和PCV-2的243bp片段，利用僅在PCV-2上有的限制性酶切片段位點(diǎn)NcoⅠ來鑒定PCV-1和PCV-2。PCV-2的PCR產(chǎn)物可被NcoⅠ切成168bp和75bp的兩個(gè)片段，而PCV-1上無NcoⅠ的位點(diǎn)，不能被NcoⅠ切割。這樣就可以直接區(qū)分PCV-1和PCV-2。經(jīng)電泳分析，PCV-1的酶切片段仍是243bp，而PCV-2的酶切片段是168bp和75bp。呂艷麗等[12]采用PCR從豬的淋巴結(jié)和脾臟中擴(kuò)增出了預(yù)期長(zhǎng)度的PCV-2DNA片段，再用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切鑒定了PCV-2PCR產(chǎn)物的特異性。

3.5　其他PCR檢測(cè)

歐陽(yáng)歲東等[13]報(bào)道，應(yīng)用RT-PCR在福建檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有豬PRRSV和PCV-2共同感染。龔振華等[14]設(shè)計(jì)了針對(duì)豬圓環(huán)病毒引物的PCR試驗(yàn)，從細(xì)胞毒及組織中直接用水煮法提取核酸，操作簡(jiǎn)便、快速，從核酸的制備到檢測(cè)出結(jié)果只需2.5h，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。KimJ等[15]建立了固定、石蠟包埋組織中最佳DNA提取及套式PCR檢測(cè)PCV-2的方法。

4　間接熒光免疫試驗(yàn)

將組織病料接種PK-15細(xì)胞玻片培養(yǎng)，丙酮固定，用兔抗PCV高免血清與細(xì)胞培養(yǎng)物中的PCV反應(yīng)，可對(duì)PCV進(jìn)行檢測(cè)和定型。周繼勇等[16]報(bào)道，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)，測(cè)定了浙江地區(qū)44個(gè)豬場(chǎng)2000年－2002年的2039個(gè)血清樣本，對(duì)不同年齡和品種豬的血清學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，浙江地區(qū)44個(gè)豬場(chǎng)均有豬圓環(huán)病毒感染，平均陽(yáng)性率為58.31%，其中種豬感染的血清陽(yáng)性率為59.38%，斷奶以后豬感染的血清陽(yáng)性率為56.65%。蘆銀華等[17]應(yīng)用間接熒光技術(shù)對(duì)幾個(gè)地區(qū)的64份臨床血樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果38份血清呈現(xiàn)PCV抗體陽(yáng)性(59%)，表明PCV已在我國(guó)普遍流行。

5　免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)

免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)是在抗原抗體特異反應(yīng)存在的前提條件下，借助于酶細(xì)胞化學(xué)的手段，檢測(cè)某種物質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)，即預(yù)先將抗體與酶連接，再使其與組織內(nèi)特異抗原反應(yīng)，經(jīng)細(xì)胞化學(xué)染色后，于光鏡或電子顯微鏡下觀察分析的形態(tài)學(xué)研究方法。StaeblerS等[18]利用單克隆抗體的IHC方法，對(duì)收集的469頭豬的淋巴組織和回腸的石蠟標(biāo)本進(jìn)行研究，這種單克隆抗體是針對(duì)PCV-2ORF2遺傳密碼的衣殼抗體。從28個(gè)農(nóng)場(chǎng)的39頭豬的組織標(biāo)本中檢測(cè)出抗體。KrakowkaS等[19]通過IHC和組織病理學(xué)對(duì)感染病毒豬進(jìn)行檢測(cè)，確定了感染PCV-2的病毒載體，尤其是淋巴組織和肝臟，與感染PCV-2豬的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度有直接關(guān)系。KimJ等[20]用IHC從流產(chǎn)胎兒和死產(chǎn)仔豬的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)出PCV-2的抗原。

6　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

針對(duì)豬圓環(huán)病毒病血清學(xué)診斷方法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是最主要的試驗(yàn)方法。McKeownNE等[21]利用ELISA，表明由母源抗體產(chǎn)生的對(duì)PCV-2感染的保護(hù)是由滴度決定的，高滴度產(chǎn)生普遍保護(hù)，而低滴度則不產(chǎn)生。LiuC等[22]將編碼PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)的序列克隆到桿狀病毒表達(dá)載體上，并將重組表達(dá)的Cap蛋白純化后作為ELISA的包被抗原。通過與免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)的比較，發(fā)現(xiàn)這種ELISA方法的敏感性和特異性都非常高，同時(shí)試驗(yàn)表明與PCV-1、PRRSV和PPV都無任何交叉反應(yīng)。殷鷹等[23]運(yùn)用ELISA對(duì)來自重慶、內(nèi)江兩地3個(gè)豬場(chǎng)的89份血清樣進(jìn)行了PCV-2檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性豬場(chǎng)。崔尚金等采用PCV抗原和正常細(xì)胞對(duì)照抗原，建立了間接ELISA，并被農(nóng)業(yè)部推薦用于流行病學(xué)調(diào)查。

7　原位核酸雜交試驗(yàn)

原位雜交組織(或細(xì)胞)化學(xué)技術(shù)(ISH)簡(jiǎn)稱原位雜交技術(shù)，屬于固相核酸分子雜交技術(shù)，它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。核酸雜交是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的雜交雙鏈。KimJ等[20]用ISH檢測(cè)了PCV-2的DNA。SegalesJ等[24]通過ISH得出器官損害的程度越嚴(yán)重，所測(cè)出的病毒基因的數(shù)量越多，在血清抽樣中測(cè)出PCV-2的遺傳量越高。國(guó)內(nèi)對(duì)ISH的報(bào)道較少。

8　結(jié)語

PCV-2引起的PMWS迄今還沒有有效的治療方法，也沒有疫苗可以使用。目前對(duì)該病的防控措施還主要停留在加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、降低飼養(yǎng)密度、減少應(yīng)激、控制進(jìn)出人員和車輛、加強(qiáng)早期疑似感染豬的診斷、隔離、淘汰等方面。國(guó)外對(duì)PCV的診斷技術(shù)進(jìn)行了大量的研究，已建立了多種方法成功地檢測(cè)PCV的抗原、抗體和核酸。國(guó)內(nèi)對(duì)PCV的研究還處于起步階段。由于我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，PMWS已在我國(guó)廣為流行，而我國(guó)對(duì)PCV病認(rèn)識(shí)不足，尚未確立標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法，當(dāng)務(wù)之急是建立一套完整的檢測(cè)PCV的方法，及早開展PMWS的調(diào)查和防控研究，同時(shí)期待PCV疫苗的早日問世。

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